徠卡倒置熒光顯微鏡電鏡標本制備方法

徠卡倒置熒光顯微鏡電鏡標本制備方法

：

徠卡倒置熒光顯微鏡的掃描電鏡觀(guān)察的表面一般是組織或器官的自然表面，如呼吸邏，消化道，泌尿及生殖管道的上皮表面。機體中分散細胞的自然表面以及骨胳等硬組織的自然面等。取材時(shí)，對于待觀(guān)察的部分要保護好，切勿用器械觸碰。如果上面粘有分泌物，粘濃或糞塊等污物，必須在固定前去除，以免遮蓋表面微紉結構，清除的方法一般是用溫生理鹽水或緩沖液沖洗或噴射沖洗，硬組織可用超聲波（低頻）清洗。有的實(shí)驗室用蛋白酶類(lèi)清洗表面的粘液，但必須注意，蛋白酶不僅可除去表面粘附物，也可破壞樣品表面的蛋白質(zhì)。對于分散細胞表面的處理參見(jiàn)另一節。需特別提出的是，暴露出的表面需要清洗，但保存標本的原則與透射電鏡標本*相同；如動(dòng)物處死方法，取材速度及要求樣品中斷血液供應后1—2分鐘內進(jìn)入團定液等。與透射電鏡標本*不同的一點(diǎn)是樣品體積可大些。由子樣品臺較大，景深較深，掃描電鏡樣品塊可在10mm見(jiàn)方，5mm高的范圍。

為確定徠卡顯微鏡分辨率，可使用半半徑（halfmdius縮寫(xiě)HR）或半距離〔hdfdLshnce縮寫(xiě)HD）這兩個(gè)參數。HR是這樣一個(gè)距離，對于一個(gè)點(diǎn)狀放射源，它所產(chǎn)生的全部顯影顆粒中的一半將落在以放射源為圓心，以HR為半徑的一個(gè)圓內；對于一個(gè)線(xiàn)狀放射源，它所產(chǎn)生的全部顯影顆粒中的一半將落在放射源兩側寬度各為HD的一個(gè)帶內。HR與M對于電鏡放射自顯影的定量分析是兩個(gè)十分重要的基本參數。

電鍍標本必須干燥。我們觀(guān)察用徠卡顯微鏡樣品是觀(guān)察細胞表面的原貌，富有微細結構的樣品表面往往經(jīng)過(guò)脫水及干燥后（特別是空氣中干燥后）發(fā)生嚴重變形。原因是液價(jià)（特別是水）的表面張力破壞了微紉結構。雖然有些可揮發(fā)介質(zhì)如乙醇或丙圍的表面張力較小，但對類(lèi)如氣管上皮表面纖毛這樣的細微結構仍有損傷。因此，自?huà)呙桦婄R問(wèn)世后，雖然不少學(xué)者擬用于觀(guān)察生物樣品，就是因為過(guò)不好“干燥"這一關(guān)而未曾得到好的生物軟組織的徠卡倒置熒光顯微鏡掃描電鍍照片。自從1969年開(kāi)始使用臨界點(diǎn)用于操作后，將掃描電鏡的生物樣品制備大大推進(jìn)了一步。目前世界上電鏡實(shí)驗室多應用臨界點(diǎn)干燥法與冷凍干燥法對掃描電鏡進(jìn)行干燥。